В современной молекулярной биологии ПЦР амплификатор (полимеразная цепная реакция) является одним из основных инструментов для изучения генетического материала. Эта техника позволяет в кратчайшие сроки в несколько раз увеличить количество конкретной ДНК-секции, что позволяет проводить различные исследования и диагностику множества заболеваний.
Устройство ПЦР амплификатора включает в себя несколько основных компонентов. Основной элемент - это термоциклер, специальное устройство, которое может осуществлять быструю термоциклизацию, то есть нагревание и охлаждение пробирки с реакционной смесью. Термоциклер содержит блок с зондами, которые обогревают пробирки и контролируют температуру внутри прибора. В верхней части термоциклера также размещен дисплей, который позволяет наблюдать за процессом амплификации.
Процесс ПЦР состоит из нескольких этапов. Первым этапом является денатурация, во время которого двухцепочечная ДНК разделяется на две одноцепочечных. Это происходит при повышенной температуре, когда геликс ДНК распадается на отдельные нуклеотиды. Затем следует этап отжига, на котором приложенные к ДНК праймеры (специфические фрагменты ДНК) начинают синтезировать новые нуклеотидные цепи. Температура на этом этапе снижается, и праймеры связываются с ДНК. Завершается процесс ПЦР этапом продления, на котором фермент ДНК-полимераза заканчивает синтезировать две новые цепочки ДНК. Все эти этапы повторяются множество раз, что позволяет получить большое количество копий исходной ДНК.
Принцип работы ПЦР амплификатора
На первом этапе, денатурации, двухцепочечная ДНК распадается на две отдельные цепочки при повышенной температуре. Это происходит благодаря воздействию высоких температур или специальных реагентов, которые разрушают связи между азотистыми основаниями ДНК.
На втором этапе, отжига, температура понижается, и праймеры (короткие последовательности ДНК) прикрепляются к целевой ДНК. Праймеры определяют область, которая будет усиливаться и делают возможным специфическую амплификацию выбранной ДНК последовательности.
На третьем этапе, экстенсии, активируется термостабильная полимераза (фермент, способный синтезировать новую ДНК цепь). Она добавляет нуклеотиды к прикрепленным праймерам, расширяя и удлиняя ДНК цепь. Этот процесс повторяется несколько раз, создавая множество копий целевой ДНК.
Таким образом, принцип работы ПЦР амплификатора заключается в использовании термоциклера для повторения циклов денатурации, отжига и экстенсии. Это позволяет получить множество копий целевой ДНК и определить ее наличие или конкретные последовательности в лабораторных исследованиях и диагностике заболеваний.
Устройство ПЦР амплификатора
Устройство ПЦР амплификатора включает в себя несколько ключевых компонентов:
1. Блок нагрева:
Он отвечает за циклическое изменение температуры в реакционной смеси. Благодаря этому блоку происходит денатурация двухцепочечной ДНК, что позволяет праймерам связаться с целевой последовательностью ДНК.
2. Блок охлаждения:
Он ответственен за снижение температуры в реакционной смеси. Это необходимо для обратного осмотра соединения праймеров с промотором и разрешение ДНК-полимеразе приступить к синтезу новой цепочки ДНК.
3. Термостабильный блок:
Он гарантирует точное поддержание заданных температурных режимов (нагрева или охлаждения) на протяжении цикла реакции.
4. Реакционная камера:
Это специальный термостабильный блок, в котором размещается реакционная смесь, содержащая шаблонную ДНК, праймеры, ДНК-полимеразу и другие компоненты. Реакционная смесь нагревается и охлаждается в соответствии с программой ПЦР.
5. Блок управления:
Он обеспечивает автоматическое управление амплификационными циклами, температурными режимами и другими параметрами реакции. С помощью этого блока настраивается и контролируется процесс ПЦР.
Благодаря такому устройству ПЦР амплификатор позволяет проводить эффективную амплификацию ДНК-целевой последовательности.
Этапы амплификации в ПЦР
1. Денатурация: на первом этапе двухцепочечная молекула ДНК разделяется на одиночные цепи путем нагревания реакционной смеси до высокой температуры (около 95°C). В результате этого процесса, гидрогеновые связи между комплементарными нуклеотидами разрушаются, и ДНК распадается на две отдельные цепи.
2. Отжиг праймеров: после денатурации, реакционная смесь охлаждается до 45-65°C, чтобы позволить праймерам (коротким одноцепочечным фрагментам ДНК) связаться с искомыми участками ДНК. Праймеры являются основными строительными блоками для синтеза новых ДНК цепей.
3. Элонгация: на этом этапе добавляется специальный фермент - термостабильная ДНК-полимераза. Она начинает прикрепляться к праймерам и инициирует построение новых нитей ДНК на основе комплементарности нуклеотидов. Фермент перемещается вдоль одной из одноцепочечных ДНК, считывает ее последовательность и синтезирует вторую странду ДНК.
4. Цикл повторяется: после первого цикла амплификации, полученные две двухцепочечные молекулы становятся матрицей для следующего цикла денатурации, отжига праймеров и элонгации. Каждый цикл удваивает количество искомой ДНК
Таким образом, последовательное повторение этих этапов позволяет получить миллионы копий искомой ДНК из исходного образца всего за несколько часов.